真核細(xì)胞rna提取的實(shí)驗(yàn)報(bào)告

時(shí)間：2024-11-26 00:12:50 報(bào)告我要投稿

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真核細(xì)胞rna提取的實(shí)驗(yàn)報(bào)告范文

　　篇一：真核細(xì)胞RNA的提取

　　一．原理

真核細(xì)胞rna提取的實(shí)驗(yàn)報(bào)告范文

　　本方法利用鹽酸胍抑制RNA酶，勻漿裂解細(xì)胞，采用有機(jī)溶劑抽提去除蛋白質(zhì)。通過選擇性沉淀RNA分子去除DNA。

　　二．方法

　　1.樣品處理

　�、沤M織樣品處理：取新鮮的組織樣品稱重后，剪碎成約1cm2的組織塊直接加入勻漿液中進(jìn)行RNA提取，或液氮中速凍-70℃保存。

　　⑵貼壁培養(yǎng)細(xì)胞處理：用PBS洗細(xì)胞一次，吸干溶液后將培養(yǎng)板快速移至液氮中冷凍后轉(zhuǎn)到-70℃保存；或加入1ml勻漿至培養(yǎng)板中直接裂解細(xì)胞，然后將粘稠的裂解液進(jìn)一步勻漿。

　�、菓腋∨囵B(yǎng)細(xì)胞處理：離心收集細(xì)胞，用PHS懸浮漂洗再田心收集，若不立即提取RNA，則可經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)至一70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

　　2．加l()倍體積鹽酸胍勻漿液[至準(zhǔn)備好的樣品細(xì)胞中，高速勻漿1min。

　　3．勻漿液5000g，室溫離心10min。

　　4．將上清移至一個(gè)干凈離心管中，加入0.1體積的3mol／L乙酸鈉（PH5.2），混勻，再加5體積預(yù)冷的乙醇，立即充分混勻，-20℃放置至少2小時(shí)。

　　5．5000g 0℃離心10分鐘沉淀核酸，棄上清液，室溫干燥。

　　6，每個(gè)提取RNA的組織或細(xì)胞樣品中，加入l0～15min鹽酸胍勻漿液Ⅱ，攪拌溶解。

　　7．加入2.5體積預(yù)冷的乙醇，立即充分混勻，-20℃至少放置2小時(shí)。

　　8．5000g 0℃離心10分鐘沉淀核酸，去上清，室溫?fù)]發(fā)乙醇。

　　9．按每克組織細(xì)胞加5min的比例．分兩次加入0.02mol／L EDTA(pH8.0) 先加1／2體積EDTA振蕩l～2分鐘，3000g離心2min．吸出上清．再加另一個(gè)1/2體積的.EDTA振蕩l一2分鐘．合并兩次核酸溶解液。．

　　10．用等體積氯仿—正丁醇(4：1)抽提核酸溶液，5000g室溫離心l0min，5000g室溫離心10min。吸出上清至另一個(gè)干凈離心管中。

　　11．加3倍體積lmol／L乙酸鈉 (PH7.0) 混勻，-20℃放置1h以上，此時(shí)RNA將選擇地沉淀，而DNA仍為溶解狀況。

　　12．5000g，0℃離心20min，沉于管底的是RNA。

　　13．吸去上清，用4℃預(yù)冷的lmol／L乙酸鈉(pH7．0)漂洗RNA沉淀。然后20℃ 5000g，離心20分鐘�；厥誖NA。

　　14．盡量去除上清液。按每g組織細(xì)胞1m的比例加入RNA溶解液(0.2％SDS，0.5％mol／L EDTA，pH8.0)。注意：若有SDS沉淀析出．滴加0.11mol／L NaOH調(diào)溶液pH至7．5。

　　15．加入2倍體積冰預(yù)冷乙醇混勻，0℃放置至少2小時(shí)，5000g，4℃離心10分鐘，RNA沉淀用70％乙醇漂洗，短暫離心后，棄上清，室溫干燥蒸發(fā)乙醇。

　　16．用適當(dāng)小容積DEPC處理過的ddH2O溶解RNA沉淀，加入3倍體積乙醇，

　　-70℃保存RNA備用。用時(shí)．加入0.1體積的3mol／L乙酸鈉，混勻，12000g，4℃離心回收RNA。

　　三.試劑

　　1．鹽酸胍勻漿液Ⅰ

　　成分：8mol／L鹽酸胍(分子量為95.6)，O．1mol／L乙酸鈉(pH5．2)，5mmol／L 2—巰基乙醇，0.5％十二烷基肌氨酸鈉

　　配制方法：取191g鹽酸胍．加8.35m1 3mol／L乙酸鈉(pH5．2)和6．25ml 0．2mol／L 2—琉基乙醇溶液中，再加水至237．5ml，混勻后加12．5ml 10％十二烷基肌氨酸鈉,振蕩混勻溶解。

　　2．鹽酸胍勻漿液Ⅱ

　　成分：8mol／L鹽酸胍(分子量力95.6),0.1mol／L乙酸鈉(pH5．2),1mmol／L 2

　　—琉基乙醇，20mmol／L EDTA(pH8.0)

　　配制方法：取191g鹽酸胍，加日．35ml 3mol／I。乙酸鈉(pH5．2)和1．25ml 0．2mol

　　／L 2—巰基乙醇溶液中，再加入10ml 0.5mol／L EDTA(pH8.0)。加水至250ml混勻。

　　3.乙醇

　　4.70％乙醇

　　5.氯仿—正丁醇(4：l，體積比)

　　6.4mol／L乙醇鈉，pH7.0

　　7.3mol／L乙醇鈉，pH5.2

　　8.RNA溶解液

　　成分：O．2％SDS．0.05mol／L EDTA, pH8.0

　　四、說明

　　提取RNA時(shí)，要特別注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均應(yīng)用0.1％的二乙基焦碳酸鹽(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理。塑料器材均使用一次性用品，并高壓滅菌處理，必要時(shí)，也可用0.1%DEPC處理。

　　篇二：真核細(xì)胞RNA的提取

　　RNA是基因表達(dá)產(chǎn)物，由以下幾類分子組成，rRNA（占細(xì)胞總RNA的80%～85%）、tRNA和核內(nèi)小分子RNA（占10～15%）、mRNA（占1～5%）。其中mRNA是分子生物學(xué)的主要研究對(duì)象，分離制備mRNA是克隆基因，分析基因表達(dá)以及建立cDNA文庫的首要步驟。

　　真核細(xì)胞總RNA分離提取的目的是要獲得高純度的具有充分長(zhǎng)度的`RNA分子，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的關(guān)鍵是盡量減少RNA酶的污染。RNA酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性的RNA酶外，環(huán)境中也存在RNA酶。因此在提取RNA時(shí)，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個(gè)無RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA酶的污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白R(shí)Nasin和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑鹽酸胍或異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶，采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。

　　一、RNA提取的關(guān)鍵

　　真核細(xì)胞RNA的提取過程有四個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即①樣品（細(xì)胞或組織）的有效破碎；②有效地使核蛋白復(fù)合體變性；③對(duì)內(nèi)源RNA酶的有效抑制；④有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；其中最關(guān)鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。提取的RNA可以用于核酸雜交、cDNA合成以及體外翻譯等。

　　二、組織RNA提取的基本步驟

　　1.儀器：勻漿器、低溫離心機(jī)、離心管。

　　2.試劑：氯仿、75%乙醇、異丙醇、DEPC溶液、1%甲醛變性膠、37%甲醛、3%過氧

　　化氫、甲酰胺、RNA上樣緩沖液。

　　3.主要步驟

　�。�1）取組織50~100mg，加0.8ml Trizol沖洗勻漿器，移入同一離心管，冰上靜置5min。

　　氯仿，充分震蕩混勻，靜置

　　0.5ml異丙醇，顛倒混勻。－

　　1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉

　　淀，

　　10min。

　　l DEPC溶液，充分溶解RNA

　　RNA溶解液，按一定比例稀釋后，紫外分光光度計(jì)測(cè)

　　值，計(jì)算OD260/OD280

　　OD260＝1時(shí)，RNA濃度約為

　�。絆D260×稀釋倍數(shù)×40

　　1%甲醛變性膠電泳觀察

　　甲醛變性凝膠板：4.5μl RNA，12000g×℃靜置2h，4℃1.7~2.0，根據(jù)下述公式計(jì)算×甲醛膠電泳緩沖液，離心。棄沉淀。 ×10min×5min離心。：1之間，說明RNA濃度：3%過氧化3.5μl 37%甲（2）加0.2ml3min，4℃15min（3）取上清，加入204℃，12000g離心。（4）棄上清，取沉淀，加入，7500g（5）棄上清，沉淀真空干燥（6）加40μ。 4.結(jié)果鑒定（1）紫外分光光度計(jì)檢測(cè)：取定260nm、280nmOD比值，如果比值在RNA純度可。標(biāo)準(zhǔn)樣品當(dāng)40μg/mlRNA濃度（μg/ml。（2）電泳檢測(cè)：RNA質(zhì)量，電泳槽及制膠板先用氫浸泡過夜；制1%，2ul 5

　　醛，10ul甲酰胺，離心混勻，65℃變性15min后，迅速置冰浴中；再加入2μl RNA上樣緩沖液，離心混勻后上樣，6V/cm電壓，電泳1～2h；暗室內(nèi)紫外光下觀察，拍照；如果觀察到清晰的18S、28S RNA電泳帶，無大量小分子RNA，說明RNA無明顯降解，樣品－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　三、注意事項(xiàng)

　　1、所有玻璃器皿160～180℃高溫干烤6h以上，非耐高溫器皿經(jīng)0.1% DEPC液浸泡后，經(jīng)高溫（15磅，20min）處理滅活RNA酶，所用試劑均用DEPC水配制，然后高壓處理。

　　2、實(shí)驗(yàn)用水要經(jīng)DEPC處理，但含Tris的試劑不能用DEPC處理。

　　3、實(shí)驗(yàn)操作過程中要戴一次性手套，以避免RNA酶污染。

　　藥大0942605

　　篇三：真核細(xì)胞rna提取

　　實(shí)驗(yàn)原理：

　　根據(jù)成熟雌蟾蜍體內(nèi)含大量卵細(xì)胞且可以方便獲取，細(xì)胞內(nèi)含核酸豐富，沒有其它組織器官等的干擾等優(yōu)點(diǎn)以確定蟾蜍卵細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)所需的真核細(xì)胞。通過TRIZOL溶液中變性劑破碎真核細(xì)胞，然后經(jīng)過氯仿等有機(jī)溶劑抽提RNA，再利用RNA不溶于異丙醇的性質(zhì)將自身析出，達(dá)到分離提純的目的。

　　TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。

　　甲基綠—吡羅紅為堿性染料，它分別能與細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA結(jié)合呈現(xiàn)不同顏色。當(dāng)甲基綠與吡羅紅作為混合染料時(shí)，甲基綠與染色質(zhì)中DNA選擇性結(jié)合顯示綠色或藍(lán)色；吡羅紅與核仁、細(xì)胞質(zhì)中的RNA選擇性結(jié)合顯示紅色。其原因可能是兩種染料的混合染液中有競(jìng)爭(zhēng)作用，同時(shí)兩種核酸分子都是多聚體，而其聚合程度有所不同。甲基綠易與聚合程度高的.DNA結(jié)合呈現(xiàn)綠色。而吡羅紅則與聚合程度較低的RNA結(jié)合呈現(xiàn)紅色（但解聚的DNA也能和派洛寧結(jié)合呈現(xiàn)紅色）。即RNA對(duì)派洛寧親和力大，被染成紅色，而DNA對(duì)甲基綠親和力大，被染成綠色。09419

　　實(shí)驗(yàn)材料：

　　（一）試劑

　　1.甲基綠—吡羅紅染料：①染色劑A液的兩種配制方法

　　第一種方法：取吡羅紅甲基綠粉1g，加入到100mL蒸餾水中溶解，然后用濾紙過濾，將濾液放入棕色瓶中備用。

　　第二種方法：取甲基綠2g溶于98mL蒸餾水中，取吡羅紅G5g溶于95mL蒸餾水中。取6mL甲基綠溶液和2mL吡羅紅溶液加入到16mL蒸餾水中，即為A液，放入棕色瓶中備用。（注意：用于核酸染色的是吡羅紅G，請(qǐng)不要錯(cuò)買吡羅紅B。）

　�、谌旧珓〣液的配制方法B液是一種緩沖液，由乙酸鈉和乙酸混合而成。先取乙酸鈉16.4g，用蒸餾水溶解至1000mL備用；再取乙酸12mL，用蒸餾水稀釋至1000mL備用。取配好的乙酸鈉溶液30mL和稀釋的乙酸20mL，加蒸餾水50mL，配成pH為4.8的B液（緩沖液）。

　�、廴旧珓┑呐渲迫旧珓┦怯葾液、B液混合配制而成的。取A液20mL和B液80mL混合，就是實(shí)驗(yàn)中所用的吡羅紅甲基綠染色劑。應(yīng)該注意的是該試劑應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。

　　2.TRIZOL試劑（Invitrogen公司購買）

　　3.75%乙醇

　　4.氯仿

　　5.異丙醇

　　6.Nacl(0.14m/l)

　�。ǘ┢鞑�

　　1.離心機(jī)（3000r.p.m）

　　2.冰浴

　　3．研缽

　　4.燒杯

　　5.量筒

　　6.試管

　　7.玻棒

　　8.膠頭滴管9

　　9.離心管

　　10.天平

　　實(shí)驗(yàn)方法：

　　制備勻漿：

　　以班級(jí)為單位，稱取大概10g蟾蜍卵細(xì)胞（2~3℃保存），于研缽（可置于冰浴鍋上）中，根據(jù)10~30mg組織細(xì)胞加1mltrizol試劑的量加入其中，快速研磨，制備勻漿。實(shí)驗(yàn)二人合作為一組，每組取大概10ml勻漿。

　　RNA的提�。�

　　取回勻漿后，室溫靜置10min，使樣品充分裂解——離心(3000r.p.s)20mins——取上清液移至新的離心管——加1/5TRIZOL溶液體積氯仿——在手中反復(fù)振蕩搖勻，室溫靜置10min。——離心20mins——取上清液——在上清中加入等體積冰冷的異丙醇，室溫放置10min�！浞只靹�，靜置10minute——離心20min——沉淀用75%乙醇洗滌兩次

　　定性試驗(yàn)：

　　取2支干凈試管，一管加入1.5MLRNA溶液（將RNA顆粒狀的沉淀溶于

　　2ML0.14/NACL溶液中），另一管加入蒸餾水1.5ML,像兩管中加入3M甲基綠-吡羅紅染色劑，溶液變成紅色為陽性反應(yīng)。

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

　　利用TRIZOL法可成功提取的RNA，并使得甲基綠-吡羅紅染色劑顯紅色。

　　實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

　　TRIzol對(duì)人體有害，使用時(shí)應(yīng)戴一次性手套，注意防止濺出。

　　由于本科生實(shí)驗(yàn)室里的為普通離心機(jī)，轉(zhuǎn)速不高，故可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間。

　　離心后，注意上清液和沉淀的取舍以及對(duì)RNA層的小心吸取，否則將導(dǎo)致RNA樣品中有DNA污染。

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