過氧化氫酶米氏常數(shù)的測定

　　一、 實驗目的

　　1. 了解米氏常數(shù)的測定方法

　　2. 學習提取生物組織中的酶

　　二、 實驗原理

　　1. 米氏反應動力學

　　米氏方程

　　(Michaelis-Menten Equation):

　　2. 米氏常數(shù)的意義：

　　① 反映酶的種類：Km是一種酶的特征常數(shù)，只與酶的種類有關(guān)，與酶濃度、

　　底物濃度無關(guān)，過氧化氫酶米氏常數(shù)。

　�、� 米氏常數(shù)是酶促反應達到最大反應速度Vmax一半時的底物濃度。其數(shù)值大

　　小反映了酶與底物之間的親和力：Km值越大，親和力越弱，反之Km值越小，親和能力越強。

　�、� Km可用來判斷酶（多功能酶）的最適底物：Km值最小的酶促反應對應底物

　　就是該酶的最適底物。

　　3.米氏常數(shù)的求法：

　　該作圖法應用最廣。但在低濃度是v值誤差較大，在等差值實驗時作圖點較

　　集中于縱軸。因此在設計底物濃度時，最好將1/配成等差數(shù)列，這樣可使點距較為平均，再配以最小二乘回歸法，就可以得到較為準確的結(jié)果。

　　此法優(yōu)點是橫軸上點分布均勻，缺點是1/v會放大誤差，同時對底物濃度的選擇有要求。<>Km時直線將在原點附近與軸相交。

　　4.氧化酶：生物體內(nèi)重要的三種氧化酶類，其作用均是消除體內(nèi)自由基： ①POD：過氧化物酶

　�、赟OD:超氧化物歧化酶

　�、跜AT：；過氧化氫酶

　　5.過氧化氫酶的作用：

　　植物體內(nèi)活性氧代謝加強而使過氧化氫發(fā)生積累。過氧化氫可進行一步生成氫氧自由基。氫氧自由基是化學性質(zhì)最活潑的活性氧，可以直接或間接地氧化細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，并且有非常高的速度常數(shù)，破壞性極強，可使細胞膜遭受損害，加速細胞的衰老和解體。過氧化氫酶（catalase，CAT）可以清除過氧化氫、分解氫氧自由基，保護機體細胞穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境及細胞的正常生活，因此CAT是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一，其活性高低與植物的抗逆性密切相關(guān)。

　　6.過氧化氫酶活力的測定方法：

　�、僮贤馕�收法：

　　過氧化氫在240nm波長下有強烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應溶液吸光度（A240nm）隨反應時間而降低。根據(jù)測量吸光度的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。（以一分鐘內(nèi)A240nm下降0.1為一個單位）

　　②滴定法（高錳酸鉀法、碘量法）

　　在反應系統(tǒng)中加入一定量（反應過量）的過氧化氫溶液，經(jīng)酶促反應后，用標準高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的過氧化氫。根據(jù)單位時間內(nèi)消耗的過氧化氫的量即可測出過氧化氫酶活力大小。

　　7.實驗中的反應 ：

　　H2O2被過氧化氫酶分解出 H2O 和 O2 , 未分解的 H2O2 用 KMnO4 在酸性環(huán)境中滴定, 根據(jù)反應前后的濃度差可以算出反應速度:

　　酶

　　2H2O2 ?→ 2H2O + O2

　　2KMnO4+5H2O2+3H2SO4 ?→ 2MnO4+K2SO4+8H2O+5O2

　　（本實驗以馬鈴薯提供過氧化氫酶）

　　三、 實驗試劑

　　1. 0.02mol/L 磷酸緩沖溶液 (pH=7.0): 實驗室提供.

　　2. 酶液: 稱取馬鈴薯 5g, 加緩沖液 10mL, 勻漿過濾.

　　3. 0.01mol/L 高錳酸鉀.

　　4. 0.098mol/L H2O2.

　　5. 25%H2SO4.

　　四、 實驗操作

　　取 6 只錐形瓶, 按下表的順序加入試劑.

　　先加好過氧化氫和蒸餾水, 加酶液后立即混合, 依次記錄各瓶的起始反應時間. 反映到達 5min 立即加入2ml 25%硫酸終止反應, 充分混勻.。用 0.01mol/L 的 KMnO4溶液滴定瓶中剩余的過氧化氫至微紅色, 記錄消耗的高錳酸鉀體積.。

　　五、注意事項：

　　1.反應時間必須準確。

　　2.酶濃度須均一，若酶活力過大，應適當稀釋。

　　3.滴定終點的判定。

　　六、實驗結(jié)果：

　　過氧化氫濃度：0.098mol/L

　　稱取馬鈴薯的質(zhì)量：5.00g

　　米氏常數(shù)Km= -0.1913

　　七、實驗結(jié)果分析：

　　1.曲線上少一個點的原因：

　　用移液管移取序號為2的過氧化氫溶液（應為1.25ml）錯誤的移取了1.75ml，故在制圖時將其舍去。

　　2.曲線線性較好（R2=0.9988）的原因：

　　本實驗采取了兩人分工的方法完成實驗，控制反應結(jié)束及滴定分別由一人完成，所以標準都相同，從而在一定程度上提高了實驗的準確性。

　　3. Km計算結(jié)果呈負值的原因：

　　Km呈負值（即整條直線都向下移動），亦即所有測定的v值都偏大。

　　由v=(c1*V1-2.5*c2*V2)/5，故推斷最可能的原因是V2整體測量偏小，可能的操作失誤是編號為0的空白對照組中高錳酸鉀的滴加量偏高，從而使除去該點的整體的高錳酸鉀量都偏小。

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