研究甲型肝炎動物模型的進展論文
摘要：目前, 關(guān)于甲型肝炎病毒 (HAV) 的致病性和宿主免疫反應(yīng)的動物模型主要是以黑猩猩和狨猴為主的非人靈長類動物。此外, 樹鼩、豚鼠、豬及基因敲除小鼠等都可在實驗條件下感染HAV并可被選擇作為替代的動物模型。本文將對實驗感染HAV動物模型的研究狀況進行綜述。
關(guān)鍵詞：甲型肝炎病毒; 實驗感染; 動物模型;
甲型肝炎 (甲肝) 與戊型肝炎 (戊肝) 較為相似, 均為急性、自限性疾病, 通過糞口途徑、人與人之間的接觸或者污染的水和食物傳播[1]。甲肝主要在衛(wèi)生環(huán)境較差的發(fā)展中國家, 例如非洲、亞洲和南美洲的部分地區(qū)流行[2]。甲型肝炎病毒 (HAV) 是引起急性病毒性肝炎的主要病原體, 屬于小核糖核酸家族的肝病毒屬, 基因組全長約7 500 nt, 為單正鏈線性RNA病毒, 包括5'非編碼區(qū) (UTR) 、蛋白質(zhì)編碼區(qū)和3'非編碼區(qū) (UTR) 。HAV非常穩(wěn)定, 具有耐熱性和耐酸性, 這一點和其它小核糖核酸家族的病毒有所不同, 該特點利于病毒的傳播[3]。HAV在血液中是以有包膜的顆粒形式存在, 而在糞便中則為裸露的、無包膜的顆粒形式[4]。目前, HAV被分為6個基因型 (I、II、III、IV、V、VI) , I-III型為人類起源, 每一型又可分為A、B兩個亞型, 其中IA型在世界范圍內(nèi)最為流行。據(jù)報道, 全球每年有超過1 400萬人新發(fā)HAV感染[5], 被感染的兒童通常沒有臨床癥狀, 而被感染的成人則會出現(xiàn)黃疸等其它臨床癥狀, 感染之后可以獲得終生免疫力。盡管由于衛(wèi)生條件改善等因素, 全球范圍內(nèi)人群中甲肝抗體的陽性率在日益下降, 導(dǎo)致了部分地區(qū)人群對甲肝的暴發(fā)流行缺乏免疫力, 因此甲肝仍然是一個值得關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。
如同乙型肝炎病毒 (HBV) 和丙型肝炎病毒 (HCV) , HAV的宿主主要局限于人類和非人靈長類動物[6]。但是HAV可成功在小鼠及豚鼠細胞中培養(yǎng), 提示其可能有其它種類的宿主存在[7-8]。目前為止, 關(guān)于HAV的致病性和宿主免疫反應(yīng)的動物模型主要是以黑猩猩和狨猴為主的非人靈長類動物[9], 尚不能準(zhǔn)確復(fù)制該病毒的致病過程的小型動物模型。本文將對甲型肝炎目前的動物模型研究情況進行分類綜述。
1. 非人靈長類動物
雖然HAV可成功感染非人靈長類動物, 但是即使在非人靈長類動物中, 該病毒的宿主范圍也相當(dāng)有限, 對HAV最為敏感的非人靈長類動物主要是狨猴和黑猩猩, 而這兩種動物的資源十分稀缺, 飼養(yǎng)和實驗操作都很困難。因此, 我們?nèi)孕枰诳紤]到實驗條件、經(jīng)濟條件和倫理范疇的情況下, 選擇最佳研究HAV的非人靈長動物種類。
1.1 狨猴
在過去很長一段時間內(nèi), 由于HAV不能在細胞培養(yǎng)中分離且缺乏可以成功感染的動物模型, 因此對于該病毒的研究一直處于停滯階段。1969年, Deinhardt等人[10]嘗試用甲肝病人血清感染狨猴, 5只中的兩只在感染后出現(xiàn)了臨床癥狀, 并且能夠傳染給其它狨猴。隨后, 多個實驗室通過分離甲肝病人的血清并感染狨猴, 證實不同種類的狨猴對HAV易感[11-14]。
雖然甲肝是通過糞口途徑傳播, 但研究發(fā)現(xiàn)在狨猴中, 靜脈注射HAV比口服病毒的感染效率更高, 且注射劑量越高, 狨猴的甲肝潛伏期就越短, 血清和糞便中出現(xiàn)陽性指標(biāo)也更早[15]。其原因可能是經(jīng)靜脈注射后, 病毒能夠迅速定植于肝臟并進行繁殖, 而經(jīng)口途徑感染的病毒須先在腸粘膜等部位定植, 之后才能入侵血液并定植于肝臟, 在肝內(nèi)進行復(fù)制并形成感染病灶。
狨猴感染甲肝后, 臨床癥狀并不明顯, 只有輕微的厭食及體重下降。在感染HAV后平均1~5周, 狨猴血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT) 和谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST) 開始出現(xiàn)升高, 隨著病程發(fā)展達到峰值并可持續(xù)3~4周, 這表明狨猴出現(xiàn)了急性肝炎并發(fā)生了肝臟損傷[16-21]。在感染病毒后一周左右, 可以在狨猴排出的糞便中檢測到HAV RNA及HAV抗原, 狨猴的糞便排毒可持續(xù)20~30 d。通過對感染甲肝的狨猴的不同器官的檢查, 發(fā)現(xiàn)不僅在肝臟中能檢測到HAV抗原, 在膽囊、脾臟等肝外器官中也可檢測到[19-21]。大多數(shù)狨猴在肝臟損傷伊始便開始產(chǎn)生抗-HAV Ig M抗體, 在達到峰值2~3周后發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換并產(chǎn)生抗-HAV Ig G抗體[19-20]。利用光鏡、電鏡、免疫電鏡和過氧化酶標(biāo)記抗體等方法進行組織學(xué)方面的檢測, 可以發(fā)現(xiàn)肝炎的組織學(xué)變化, 例如肝細胞嗜酸性變、肝臟細胞壞死和凋亡、氣球樣變性、肝巨噬細胞增殖等, 病毒顆�？沙霈F(xiàn)于肝細胞、肝巨噬細胞及微膽管上皮細胞等[20-21]。
此外, Provost等人的研究表明, 向狨猴注射HAV的野毒株和經(jīng)細胞培養(yǎng)傳代的疫苗株后, 狨猴對于二者的反應(yīng)有所不同, 經(jīng)過細胞培養(yǎng)傳代的疫苗株所引起的肝臟生化及組織學(xué)的指標(biāo)均有所下降, 而且病毒在肝內(nèi)的復(fù)制和糞便中排出量也相應(yīng)減少[22-23]。因此狨猴不僅可作為甲肝病毒感染的動物模型, 也可作為測試毒力指標(biāo)的模型。
1.2 黑猩猩
自然環(huán)境下, 黑猩猩感染HAV和抗-HAV抗體存在的幾率較高, 約有90%的野生黑猩猩攜帶抗-HAV的抗體, 故不適合用作HAV感染研究, 并且導(dǎo)致了在過去的實驗條件下用HAV感染新捕捉的黑猩猩的失敗率較高[24]。隨著對于抗-HAV抗體的血清學(xué)檢測方法的發(fā)展, 人工培育的黑猩猩可以通過血清中的抗-HAV抗體篩選并選擇陰性者進行感染實驗, 隨后許多研究均表明黑猩猩可以成功感染HAV[25-26]。
雖然甲肝的傳播是通過糞口途徑, 但同狨猴一樣, 對黑猩猩進行靜脈注射病毒的感染率高于經(jīng)口感染, 而且注射劑量越高, 潛伏期也越短[15]。黑猩猩在感染HAV后, 會出現(xiàn)輕度的急性肝炎相應(yīng)的臨床癥狀, 但臨床癥狀一般比較輕微[27]。在感染病毒后14 d, 可在黑猩猩血清中檢測到病毒, 病毒血癥持續(xù)大約兩周, 而糞便排毒出現(xiàn)在感染病毒后10 d左右, 可持續(xù)3周[27-29]。感染病毒21 d后, 除了糞便及血清中可檢測到病毒外, 還可在黑猩猩肝臟以及膽汁、扁桃體、唾液等中檢測到HAV抗原, 并可用免疫電鏡觀察到病毒顆粒[28-31]。隨后, 可在黑猩猩血清中檢測到甲肝抗體的出現(xiàn)及抗體的血清學(xué)轉(zhuǎn)換[30-32]。感染病毒后15~30 d天左右, 黑猩猩血清中的轉(zhuǎn)氨酶等生化指標(biāo)升高達到最高值[30-33], 而血清學(xué)指標(biāo)的上升通常是肝臟損傷的直接證據(jù)。此外, Maynard等人[34]的研究結(jié)果表明, 在感染了HAV的黑猩猩的血清中, 可檢測到循環(huán)免疫復(fù)合物, 可能與體內(nèi)對病毒清除的機制以及相應(yīng)的免疫反應(yīng)有關(guān), 而循環(huán)免疫復(fù)合物在患有甲肝的人類中很少有所關(guān)注。
雖然黑猩猩是研究甲型肝炎的理想動物模型, 并且之前對于HAV的致病性研究主要依賴于黑猩猩為主的動物模型, 然而由于價格昂貴、來源困難, 飼養(yǎng)條件苛刻、實驗操作復(fù)雜, 因此其在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究中具有一定的局限性, 有些國家已經(jīng)明令限制黑猩猩用于實驗, 并倡導(dǎo)使用替代的實驗動物[35]。
1.3 其它非人靈長類動物
除了狨猴及黑猩猩, 還有研究表明HAV可以成功感染夜猴、食蟹猴、短尾猴、恒河猴、松鼠猴等其它種類非人靈長類動物[36-41]。這些種類的非人靈長類動物, 在感染HAV后, 均可以出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)氨酶的升高、糞便排毒、抗-HAV抗體的產(chǎn)生以及肝臟病理學(xué)改變等肝炎引起的表現(xiàn)[36-41], 但相較于狨猴和黑猩猩而言, 這些非人靈長類動物雖然能夠被HAV感染, 其糞便排毒、肝臟酶學(xué)改變、肝臟病理學(xué)改變等, 均變化不明顯。此外, 也有研究表明恒河猴、卷尾猴、綠長尾猴以及梟猴在注射了HAV之后, 只產(chǎn)生抗-HAV抗體而沒有產(chǎn)生肝炎的表現(xiàn)[42], 這些結(jié)果的差異可能是由于動物種類的不同, 也可能是由于所選用的動物在入組前已經(jīng)被感染了, 需要重復(fù)驗證。
1.3.1 食蟹猴
通過對自然狀況下食蟹猴的血清檢測, 發(fā)現(xiàn)野生食蟹猴在自然環(huán)境中可以感染HAV, 感染HAV后其ALT等酶學(xué)指標(biāo)也會相應(yīng)上升, 而且食蟹猴的抗-HAV抗體血清陽性率與體重成正比[43-44]。在對食蟹猴進行HAV感染后, 沒有出現(xiàn)人類患急性肝炎時的`臨床表現(xiàn), 但其ALT等酶學(xué)指標(biāo)相應(yīng)升高, 其糞便、血清中可檢測到HAV RNA, 血清中的抗-HAV抗體也呈陽性, 同時肝臟出現(xiàn)相應(yīng)病理學(xué)改變[39,45,46]。此外, HAV也可在食蟹猴的肝外器官如唾液腺進行復(fù)制[39]。
1.3.2 恒河猴
與食蟹猴類似, 在感染HAV之后, 恒河猴的糞便中可以檢測到HAV RNA, 血清中也相應(yīng)出現(xiàn)抗-HAV抗體, 但其肝臟病理性變化較為輕微, 并且其中一些感染HAV的恒河猴ALT等酶學(xué)指標(biāo)仍處于正常范圍內(nèi)[45,47-48]。
1.3.3 夜猴
在自然環(huán)境中, 夜猴可被HAV感染, 并且夜猴之間也可相互傳染, 但感染后的抗體陽性率較低[36]。通過靜脈注射或者經(jīng)口途徑, 均可成功使夜猴感染HAV, 感染后夜猴出現(xiàn)糞便排毒、抗-HAV抗體的產(chǎn)生以及ALT等酶學(xué)指標(biāo)的升高, 組織學(xué)結(jié)果也表明肝臟出現(xiàn)類似于人類肝炎變化, 例如壞死、退行性變、炎性細胞增生等現(xiàn)象[37-38,49]。
總之, 在非人靈長類動物中, 目前對HAV最為易感的是黑猩猩和狨猴, 其它種類的非人靈長類動物雖然也可以成功感染HAV, 但臨床癥狀、生化指標(biāo)、肝臟病理學(xué)改變等不如黑猩猩和狨猴明顯。HAV的宿主范圍局限在人類和非人靈長類之中而且非人靈長類動物感染HAV的疾病過程與人類較為相似, 故之前的研究主要采用非人靈長類動物, 但由于其資源稀缺, 且飼養(yǎng)困難、實驗操作復(fù)雜, 故亟需建立可替代的實驗動物模型。
2 其它種類動物模型
2.1 豬
Song等人[50]在460份不同年齡段的豬的血清中, 用酶聯(lián)免疫吸附實驗 (ELISA) 方法檢測出豬在自然環(huán)境下抗-HAV抗體陽性率為3.5%。隨后, 他們分別通過經(jīng)口及靜脈注射對豬進行了HAV感染, 病毒血癥及糞便排毒均在注射病毒后一周左右出現(xiàn), 而抗-HAV抗體則在病毒注射后28 d出現(xiàn), 持續(xù)時間為15 d。此外, 只有靜脈注射組的豬出現(xiàn)了抗-HAV抗體, 而經(jīng)口感染組的豬沒有出現(xiàn)抗體。通過對豬的肝臟組織學(xué)檢測, 可發(fā)現(xiàn)炎性細胞浸潤等組織學(xué)變化, 在肝外組織中, 淋巴結(jié)等組織也出現(xiàn)了相應(yīng)的病理學(xué)改變。但是, 被感染的豬均沒有出現(xiàn)發(fā)熱、黃疸等肝炎的臨床表現(xiàn), 而且經(jīng)感染的豬血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及總膽紅素水平與對照組豬并無顯著性差異。Song等人認(rèn)為[50], HAV可以在豬的體內(nèi)復(fù)制, 豬可替代非人靈長類動物, 成為HAV感染的動物模型。但豬在感染HAV后, 其臨床表現(xiàn)及血清標(biāo)志物水平均沒有顯著變化, 用于感染相關(guān)的研究仍有局限。
2.2 豚鼠
由于HAV可以在豚鼠細胞中成功培養(yǎng)[51], 提示HAV的復(fù)制可能不局限于靈長類動物細胞中。2001年Hornei等人[52]嘗試HAV能否在實驗條件下感染豚鼠, 通過經(jīng)口及靜脈注射對豚鼠進行了病毒感染后, 他們發(fā)現(xiàn)在感染后2-3周, 豚鼠開始出現(xiàn)糞便排毒及病毒血癥, 經(jīng)口感染的豚鼠出現(xiàn)的時間晚于靜脈注射者。感染60 d后, 對豚鼠肝臟進行組織學(xué)檢查, 發(fā)現(xiàn)明顯的炎性浸潤及肝細胞壞死等改變, 另外, 豚鼠的小腸、淋巴結(jié)、脾臟等肝外組織也發(fā)生了病理性改變。但是, 在整個感染過程中, 豚鼠血清中均沒有出現(xiàn)抗-HAV抗體, 谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶等生化指標(biāo)也與對照組豚鼠沒有顯著性差異。Hornei等人[52]認(rèn)為豚鼠沒有出現(xiàn)抗體及生化指標(biāo)異常的原因是所注射的病毒載量較低, 故認(rèn)為豚鼠適宜作為研究HAV感染所引起的病理改變的模型, 但不適宜作為比較抗體、生化指標(biāo)的模型。
2.3 基因敲除小鼠
之前研究表明, HAV的復(fù)制能夠被I型干擾素抑制[53], 而且被HAV感染的黑猩猩體內(nèi)的I型干擾素反應(yīng)被明顯抑制[54], 因此Hirai-Yuki等人[55]給I型干擾素受體和II型干擾素受體雙敲除的小鼠靜脈注射了HAV, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙敲除小鼠出現(xiàn)了糞便排毒及低水平的病毒血癥, 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平也有所升高。感染后28 d, 雙敲除小鼠血清中可以檢測到抗-HAV抗體, 感染后37~41 d, 小鼠肝臟也出現(xiàn)了肝細胞凋亡和壞死等病理學(xué)改變。
隨后, Hirai-Yuki等人又用HAV分別感染了線粒體抗病毒信號分子 (MAVS) 敲除小鼠和I型干擾素受體敲除小鼠, 發(fā)現(xiàn)二者在感染7 d后, 均出現(xiàn)糞便排毒, 感染15 d后能夠在肝臟中檢測到病毒RNA。然而, 只有I型干擾素受體敲除小鼠出現(xiàn)了谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平的升高和肝細胞壞死等組織學(xué)改變, 線粒體抗病毒信號分子敲除小鼠則沒有顯著改變。因此, Hirai-Yuki等人認(rèn)為, I型干擾素受體敲除小鼠可以作為研究HAV的動物模型, 而且線粒體抗病毒信號分子介導(dǎo)的干擾素信號通路可能與肝臟損傷有關(guān)。但由于其為基因敲除小鼠, 制備較為困難、繁瑣, 且不能模仿生理情況下對HAV感染的反應(yīng), 故應(yīng)用受限。
2.4 樹鼩
樹鼩是一種介于食蟲目和靈長目之間的動物, 在我國廣西、云南等地區(qū)分布廣泛, 因其與猴類等相比, 數(shù)量較多, 具有對多種人類疾病的易感性, 如乙肝、丙肝等[56-58], 故具有重要的科學(xué)研究價值。
詹美云等[59]用5%的甲肝病人糞便懸液, 通過經(jīng)口感染方式感染了9只樹鼩。結(jié)果表明, 感染后樹鼩沒有出現(xiàn)明顯的急性肝炎的臨床表現(xiàn)。在感染后7~13d, 有7只樹鼩出現(xiàn)糞便排毒現(xiàn)象, 并且持續(xù)12~27 d, 說明HAV能夠在樹鼩體內(nèi)進行繁殖。在感染后2~16周, 有78%的樹鼩血清中出現(xiàn)了抗-HAV的抗體, 但抗體的滴度比較低, 可能和病毒毒力或者樹鼩的免疫力有關(guān)。此外, 部分樹鼩出現(xiàn)了ALT等肝臟相關(guān)酶學(xué)指標(biāo)的升高, 以及肝臟充血、水腫等病理學(xué)改變。這些結(jié)果都提示HAV可以在樹鼩的體內(nèi)進行復(fù)制。樹鼩在我國數(shù)量較多, 資源豐富, 故可作為甲型肝炎的動物模型而被使用。但由于其沒有明顯的臨床表現(xiàn)且出現(xiàn)糞便排毒的比率不高, 故在相關(guān)研究中仍具有局限性。
綜上所述, 由于非人靈長類動物能夠模擬人類罹患甲肝的自然病程及轉(zhuǎn)歸, 仍是甲肝相關(guān)研究的理想動物模型。而在非人靈長類動物之中, 又?jǐn)?shù)黑猩猩和狨猴對甲肝病毒最為易感, 感染HAV后能夠產(chǎn)生類似人類感染的臨床癥狀, 并且不同研究結(jié)果一致。其它種類的非人靈長類動物模型對于感染HAV后產(chǎn)生的臨床癥狀不同學(xué)者報道有所差異, 故這些種類的非人靈長類動物作為HAV感染的動物模型仍有待證實。總之, 非人靈長類動物還是目前最適合作為HAV感染的動物模型, 但由于其數(shù)量稀少、飼養(yǎng)困難、實驗操作復(fù)雜, 以及動物倫理及保護等考慮, 因此, 已有規(guī)定在實驗中限制使用非人靈長類動物的數(shù)量。此外, 樹鼩、豚鼠、豬及基因敲除小鼠等, 都可在實驗條件下感染HAV。但是這些種類的動物作為HAV感染的動物模型仍然不夠理想, 在臨床表現(xiàn)、實驗室指標(biāo)、病理改變等方面都與靈長類感染HAV不盡相同。雖然這些動物均有局限性, 但仍可被選擇作為替代的甲肝動物模型用于相關(guān)實驗研究。
3. 展望
近年來, 由于我國衛(wèi)生環(huán)境條件的改善以及甲肝疫苗的普遍接種, 我國甲肝的患病率有所下降, 但每年新增的甲肝患者數(shù)量告訴我們, 甲型肝炎仍然是一個不容忽視的公共衛(wèi)生問題。目前, 在HAV的發(fā)病機制及抗病毒藥物等方面的研究仍比較缺乏。隨著對于HAV感染的實驗動物模型的進一步研究, 人們對于HAV的致病機制也會認(rèn)識得更加深入, 而這對于防控甲型肝炎也有重要意義。
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